کلینیک گیاه پزشکی کُر

مدیریت بیماری ها، آفات و علف های هرز گیاهان زراعی

کلینیک گیاه پزشکی کُر

مدیریت بیماری ها، آفات و علف های هرز گیاهان زراعی

پیام های کوتاه
آخرین نظرات

کلینیک گیاه پزشکی کُر

 

 

عنوان:

    جداسازی قارچ های خاکزیی

(Isolation of soil Fungi)

 

کارشناسان کلینیک

 مرتضی تابنده بخت  (مسئول فنی)

                                            

                                               تابستان 1392

 

 

Contents

مقدمه. 3

قارچ چیست؟. 3

نقش قارچ ها: 3

برای چه از خاک قارچ جدا کنیم؟. 4

انواع   قارچ های خاک: 4

نقش قارچ ها در خاک: 5

عوامل موثر بر قارچ های خاک : 5

استخراج و آماده سازی نمونه خاک.. 7

زمان نمونه برداری.. 8

جداسازی از خاک.. 8

روش جداسازی مستقیم عبارتند از. 8

روش ترقیق در پتری.. 8

آماده کردن محیط کشت جداسازی.. 9

قارچ کش ها 10

وسایل و مواد مورد نیاز: 10

خواص ظاهری قارچ برای شناسایی. 11

نمونه های جمع آوری شده 11

روش های کشت نمونه. 11

روش کار. 12

تهیه سوسپانسیون خاک.. 12

کشت دادن سوسپانسیون خاک بر روی محیط کشت.. 12

تکرار کشت نمونه ها 13

جدا سازی قارچ فیتوفترا از خاک.. 13

تله کاغذ صافی. 13

تعداد کلنی های تشکیل شده در محیط  T+N+PDF. 13

قارچ های جداشده 14

Saprolegnia. 14

Phytophthora. 14

Rhizopus. 15

Mucor 16

Aspergillus. 17

Penicillium.. 18

Cladosporium.. 19

Chrysosporium.. 19

Alternaria. 20

Graphium.. 21

نتیجه. 22

منابع و مآخذ: 22

 

مقدمه

˜ قارچ چیست؟

قارچ های موجودایت کوچک، عموماً میکروسکوپی، دارای هسته، اغلب رشته ای، منشعب مولد هاگ و عاری از سبزینه هستند. قارچ ها، دیواره سلولی حاوی کتین و گلوکان (بدون سلولز) به عنوان استخوان بندی دارند که دربستری از پلی ساکاریدها و گلیکوپروتئین ها تثبیت شده اند. گروهی از موجودات شبیه قارچ، یعنی اُاُمیکوتا که اُاُمیست ها نامیده می شوند تا سال 1990 قارچ های حقیقی شناخته می شدند. با چند استثناء دیواره سلولی غالب اُاُمیست ها دارای گلوکان و مقدار کمی سلولز ولی فاقد کتین است. اُاُمیکوتا در حال حاضر در سلسله کرومیستا قرار دارند نه قارچ ها اما به خاطر زیادی شباهت هایشان به قارچ، حداقل از نظر تولید بیماری در گیاهان، همچنان قارچ در نظر گرفته می شوند. بسیاری از قارچ ها دارای بدنه رویشی رشته ای به نام میسلیوم هستند. میسلیوم از تمام جهات انشعاب پیدا می کند. هر یک از انشعاب های میسلیوم ریسه نامیده می شود. ضخامت ریسه ها یکنواخت و معمولاً در حدود 2 تا 10 میکرومتر است اما در برخی از قارچ ها ممکن است به بیش از 100 میکرومتر برسد. طول میسلیوم در برخی از قارچ ها فقط چند میکرومتر است اما در بعضی ممکن است به چندین متر برسد (اگریوس، 2005).

مطالعه روی قارچ های خاکزی به مراتب دیرتر ازباکتریها اغاز شد بطوریکه تاریخچه جداسازی قارچها به سال1886 برمیگردد.بعدازآن درسال 1902 اورمانس وکرنینگ این قارچهاراباجزییات بیشتری موردمطالعه قراردادندوازپیشگامان مطالعه روی قارچهای خاکزی میتوان هاگم(1907-1960)، لندر(1908)، وال(1912)، بچ ویت(1911)وجنسن(1912) رانام برد. تا اینکه درسال 1916 واکسمن این سوال راکه "آیاخاک واقعا محل زندگی قارچ است یامحل استراحت اسپورهای قارچ" رامطرح کرد وبعدها به این نکته پی برد که قارچها درخاک رشدوتکثیر پیدا میکنند و درواقع پی برد که برای بیشتر قارچ ها، خاک محل  استراحت آنها بوده ولی بسیاری ازقارچها نیز تمامی مراحل زندگی خود را درخاک به سر می برند.

نقش قارچ ها:

قارچها نقشهای زیادی در خاک دارند ازجمله اینکه میتوان بعنوان پاتوژن گیاهی، شرکت فعال درتجزیه بقایای گیاهی و جانوری و شرکت در روابط میکوریزی را نام برد . قارچهارا نمیتوان باچشم غیر مسلح مشاهده کرد(جزقارچهای چتری که باچشم دیده میشوند). بر اساس ارزیابی های انجام شده ثابت شده که در هر گرم خاک حاصلخیز10تا100متراز رشته های قارچی وجود دارد که اگر طول هر رشته 5 میکرومتر و وزن مخصوص آن2/1 گرم  در سانتیمتر مکعب باشد وزن قارچ در خاک تقریبا100پوند میباشد.بهترین محل برای مطالعه قارچها ناحیه ریزوسفر است که قارچهای میکوریز در انجا ساکن اند . درمطالعات انجام شده مشاهده شده که اگر به خاک مواد غذایی اضافه شود قارچ از حالت استراحت خارج شده وشروع به فعالیت میکند علاوه بر این مواد غذایی باعث رشد ریشه وافزایش فعالیت جانوران خاک نیز میشود . تاکنون فقط حدود 50درصد ازقارچهای خاکزی شناسایی شده اند .ا ین مسئله بدلیل ناقص بودن روشهای جداسازی وروشهای شمارش قارچهای خاکزی است که هرکدام محدودیت خاص خود را دارند .

برای چه از خاک قارچ جدا کنیم؟

عده ای ازقارچ های خاک زاد جزو عوامل بیماری زای خطرناک گیاهی بوده که هر ساله خسارات هنگفتی به محصولات کشاورزی وارد کرده و کمبود تولیدات گیاهی از جمله مواد غذایی را باعث می شوند برای جلوگیری از خطرات ناشی از عوامل فوق الذکر، جداسازی، تشخیص و مطالعه ی آن ها الزامی می باشد. وقتی که ریشه های گیاه قربانی تهاجم میکروبی می شوند، اغلب جمع آوری سرنخ کافی برای معرفی مستقیم و بدون ابهام مهاجم مشکل می باشد در چنین حالتی و در صورت امکان با در اختیار گذاشتن یک ماده ی غذایی طبیعی یا مصنوعی مناسب برای رشد مهاجم، سعی می کنیم حضور مهاجم را، علی رغم اعمال رقابت از طرف دیگر میکروارگانیسم های خاک آشکار کنیم. پس از آن با تجدید کشت، کشت خالصی به دست آورده که می تواند برای مطالعات بعدی در کلکسیون نگه داری شود. حقیقت این است که از چند سال پیش تکنیک های سریع و مؤثری برای شناسایی عوامل بیماری زا در محل حمله به وجود آمده است. یک حجم از خاک حتی اگر کوچک باشد شامل هزاران گونه ی میکروبی متفاوت می باشد. در نتیجه کاری نادرست خواهد بود که سعی شود قارچ های کند رشد را که اغلب فعالیت ساپروفیتی آنها نیز کاهش یافته است، روی محیط کشت های معمولی که به سرعت مورد تهاجم قرار می گیرند به نمایش بگذاریم، در نتیجه باید موادی را پیدا کنیم که رشد قارچ های مورد نظر را تحریک و با رشد رقبای آنها را محدود کرده یا از آن جلوگیری نماید (داوت و راکسل، 2006).

انواع   قارچ های خاک:

تقریبا تمامی رده های اصلی قارچ هادر خاک  وجود دارند.قارچهای ناقص درخاک بیشترازسایر قارچها هستند براساس ساختمان و خصوصیات فیزیکوشیمیایی مختلف خاک ،قارچ های متفاوتی در خاک یافت میشود،حتی در دو مکان نزدیک به هم در خاک ممکن است شباهت زیادی ازنظر نوع قارچها وجود نداشته باشد. تقریبا حدود 690قارچ که متعلق به 170 جنس بوده را از خاک جدا کرده اند که 10 جنس آن که شامل Penicillium, Aspergillus,  Mucor Achlya,Pythium,Saprolegnia,Martierella, Fusarium, Chaetomyum, Monosporium بیش از نیمی از قارچهای خاکزی هستند . قارچهای ناقص درخاک معمول ترازسایر گروه های قارچی هستند که آسپرژیلوس ها وپنی سیلیوم ها بیشترین جمعیت از قارچ ها هستند . معمولا آسپرژیلوس در مکانهای گرم و پنی سیلیوم در مکانهای سرد فراوانترند.البته قارچهای دیگری مثل آکومیست ها یاکپکهای لزج نیز در خاک وجود دارند.گروه دیگر شامل مخمرها میباشند که تک سلولی اند و بوسیله جوانه زنی یاتقسیم دوتایی تکثیر پیدا میکنند .

نقش قارچ ها در خاک:

قارچها در خاک نقش های مهمی دارند که شامل :

الف)استفاده از مواد کربنی : که از این نظر به 5 دسته تقسیم میشوند: قارچهای ساپروفیت قندی،تجزیه کننده های لیگنین، قارچهایی که از فضولات استفاده میکنند،قارچهای شکاری وقارچهای مستقر در ریشه   

ب)استفاده از مواد پروتئینی : بسیاری از قارچها در تشکیل آمونیوم و ترکیبات نیتروژنی ساده در خاک دخالت دارند.

ج)ایجاد رابطه انگلی با گیاهان : بعضی از قارچهاوپاتوژن ریشه هستند مثل گونه های ساپروفیت که به عنوان پاتوژن عمل میکنند وبه بافتهای زنده حمله میکنند.

د)تشکیل مایکوریز:  بعضی از قارچها با ریشه گیاهان همزیستی ایجاد کرده که مایکوریزنامیده میشود که دونوع همزیستی میکوریزی به نام اندومیکوریز واکتومیکوریز وجود دارد.دراکتومیکوریز قارچهای همزیست عمدتا از بازیدیومیست وتعدادی آسکومیست بوده در حالیکه در اندومیکوریز قارچها از نوع زیگومیست بوده است.

 عوامل موثر بر قارچ های خاک :

عوامل محیطی در زنده ماندن ،سازگاری واستقرار قارچها در خاک موثر اند .وضعیت مواد آلی،غلظت یون H، درجه حرارت،رژیم رطوبتی،تهویه،فصل سال ونوع پوشش گیاهی عوامل محیطی مهمی هستند که در توزیع قارچها در خاک تاثیر دارند.

مواد آلی:

پراکندگی قارچها در خاک بوسیله مواد کربنی قابل اکسید شدن تعیین میشود از آنجایی که سطح بالایی خاک غنی از مواد آلی است لذا این لایه دارای جمعیت قارچی بالایی نیز میباشد وچون با افزایش عمق مواد آلی کاهش پیدا میکند پس جمعیت قارچ نیز کاهش پیدا میکند . درخاکهای طبیعی مقدار مواد آلی و جمعیت قارچها تقریبا ثابت میباشد در حالیکه در خاکهای کشت شده وضعیت متفاوت است بدلیل اضافه کردن بقایای گیاهی ،کودهای سبز ویا سایر مواد کربنه غنی از انرژی به این خاکها جمعیت قارچ ها افزایش پیدا میکند .

غلظت یون H:

واکنش اسیدی برای قارچهای خاک مناسبتر است اما استثنائاتی هم وجود دارد مثلا کپکهای مخاطی ،آسپرژیلوس وپنی سیلیوم در محدوده وسیعی از pH قادر به رشد هستند در pH اسیدی جمعیت باکتریها و اکتینومیست ها کمتر است پس قارچها غالب میشوند وتغیر وتبدیلهای بیوشیمیایی تحت کنترل قارچها است.

قارچهای خاکزی دراثر افزودن کودهای شیمیایی به خصوص کودهای آمونیومی به خاک افزایش  پیدا میکند زیرا به علت اکسیداسیون میکروبی نیتروژن و تشکیل اسید نیتریک ،اسیدیته خاک زیاد میشود.

درجه حرارت:                                                                                 

نقش مهمی در جمعیت قارچهای خاک دارد چون بیشتر قارچها مزوفیل اند افزایش بیش ازحد درجه حرارت اثر معکوس روی آنها دارد درجه حرارتهای خیلی زیاد وخیلی کم به جز در مورد قارچهای ترموفیل برسایر قارچها اثرمعکوس دارد.

رژیم رطوبتی :

جمعیت قارچی بارژیم رطوبتی رابطه مثبتی داشته همچنین فراوانی وکارایی آنها نیز در خاک بامقدار آب رابطه مستقیم دارد قارچها نیز مثل سایر جانوران برای زنده ماندن به آب نیاز دارند رطوبت 15 تا30 درصد برای آنها مناسب است وکمتر یا بیشتر از آن برای رشد آنها مناسب نیست.

تهویه:

قارچها به علت هوازی بودن بیشتر در چند  حدود 10 سانتی متری لایه فوقانی خاک یعنی جایی که تبادلات گازی انجام میگیرد فراوانند درافق های پایین تر جمعیت آنها به علت کمبود اکسیژن وزیادی دی اکسید کربن کاهش پیدا میکند.

 فصل سال :

روی جمعیت میکروفلور خاک موثر است .تغییرات فصلی بیشتر در نواحی گرمسیری مشاهده شده است رژیم رطوبتی وحرارتی به همراه عناصر غذایی قابل دسترس که با تغییرات فصلی تغییر میکند برجمعیت قارچها موثر است. سیستم کشت فصلی نیز بر قارچها موثر است.مثلا در زمستان که درجه حرارت به شدت کم میشود بسیاری از قارچها از بین میروند اما برخی از قارچهای در حال استراحت اگر در شرایط دشوار قرار بگیرند فعالیت بیولوژیکی خود را کاهش میدهند وقادر به ادامه زندگی میباشند واگر شرایط مساعد شد وضعیت به حال اولیه برمیگردد.

 پوشش گیاهی:

این عامل نیز روی جمعیت قارچها اثر میگذارد .ساختمان وخصوصیات خاک تحت تاثیر پوشش گیاهی است.

میکوریز:

برخی ازقارچهای موجود در خاک ومنطقه ریشه ارتباط خیلی نزدیک با ریشه گیاهان دارند که از نوع همزیستی است واین ارتباط از نوع بیماریزایی نیست.فرانک (1885) برای اولین بار واژه خاص مایکوریز رابرای چنین ارتباط نزدیک بین ریشه ها و هیف های قارچ پیشنهاد کرد . هم اکنون میدانیم که همزیستی میکوریزی تقریبا در تمام گیاهان عالی یک پدیده معمول ورایج محسوب میشود وفقط تعدادی معدودی از گونه های گیاهی از این امر مستثنی هستند.

استخراج و آماده سازی نمونه خاک

نمونه برداری مرحله ای مهم می باشد. نمونه برداری از خاک های زراعی باید از لایه ی زراعی خاک باشد که به دلیل کاری که روی آن انجام می شود و نیز به دلیل باروری آن به وسیله ی ریشه های مویین گیاهان زراعی اشغال می شود. بنابراین، معمولاً در این لایه که cm40-30 ضخامت دارد به دنبال قارچ های خاک می گردیم. نمونه برداری به کمک سایلی مثل مته، بیلچه، کاردک که استریل هستند، انجام می شود.  روش متداول مورد استفاده جمع آوری حدود 20 نمونه 500 گرمی در هر هکتار می باشد که در امتداد دو قطر زمین و یا در ناحیه بیمار جمع آوری می کنیم سپس ناخالصی های زنده و غیر زنده ی خاک را از آن جدا می کنیم (سنگ، ماسه و ریشه و چوب).

زمان نمونه برداری

قارچ های خاک این توانایی را دارند که خود را به صورت اندام های استراحتی (اسکلروت، اسپور، کلاسیدوسپور و ...) یا به صورت میسیلیوم (فعال یا غیر فعال) حفظ نمایند در نتیجه نمونه برداری می تواند در زمان های مختلف سال باشد. نمونه برداری در انتهای دوره ی برداشت (خطر تخمین بیش از اندازه) یا در آخر یک دوره ی خیلی خشک (خطر تخمین کمتر از اندازه) توصیه نمی شود.نمونه باید در دمای حدود 25-20 درجه سانتی گراد خشک شده و سپس در کیسه پلاستیکی جمع آوری و در مکان خنکی (6-4 درجه سانتی گراد) نگه داری
می شوند. ترجیحاً نمونه باید در اسرع وقت مورد استفاده قرار گیرد ولی اگر چند ماه هم نگهداری شود مشکلی ندارد.

جداسازی از خاک

دو روش اصلی برای ردیابی حضور قارچ های خاک و جداسازی آنها وجود دارد:

1-     روش مستقیم: رشد پرگنه های قارچ مستقیماً روی یک محیط کشت غذایی کم و بیش انتخابی بدست می آید. برای این کار یا با وارد نمودن خاک در محیط کشت یا به ندرت از طریق فرو بردن محیط کشت متصل به یک قیم در خاک عمل می شود. این روش ها تنها برای قارچ هایی که قادر به رشد ساپروفیتی
می باشند
، قابل استفاده است.

2-     روش غیر مستقیم: شامل به طعمه انداختن قارچ در خاک به کمک مواد زنده یا غیر زنده و سپس جدا کردن قارچ از این بستره ها، در زمانی که دوره زندگی قارچ این اجازه را به ما بدهد، می باشد.

روش جداسازی مستقیم عبارتند از:

1-     ترقیق در پتری

2-     وارد کردن مستقیم خاک

 

روش ترقیق در پتری

اساس این کار شامل نگه داری سوسپانسیون خاک در آب سترون و سپس وارد نمودن غلظت متفاوتی از سوسپانسیون در محیط کشت جداسازی می باشد. این روش شامل چندین مرحله بوده که از آماده سازی غلظت ها شروع شده و تا بررسی و تفسیر نتایج ادامه دارد.غلظت ها با افزایش مقدار مشخصی از خاک که معمولاً 10 گرم به 90 میلی لیتر از آب سترون تهیه شده و سپس با تکان دادن آن برای مدت معلوم که معمولاً 30 ثانیه است ادامه می یابد. این عمل باعث تولید محصولی به غلظت  می شود. برداشت متوالی 10 میلی لیتر از این سوسپانسیون و سپس وارد کردن به 90 میلی لیتر آب سترون دیگر باعث تهیه محلول  می شود و این عمل را چند مرحله تکرار می کنیم که معمولاً تا مرحله ی  پیش می روند باید یادآوری شود که هنگام تهیه کردن نمونه با غلظت های مختلف استفاده از پیت های سترون که باید برای هر دقتی تعویض گردند بسیار مهم می باشد. در مرله تهیه سوسپانسیون اضافه کردن عوامل پخش کننده به سوسپانسیون برای پخش  معلق ماندن ذرات مؤثر است. ما می توانیم از مواد شوینده یا مواد پیچیده تر مشابهی مثلاً کالگون که برای نرم کردن آب استفاده می شود ولی اشکال این کار این است که رشد میسیلیوم ها را کند می کند.پخش یکنواخت مواد بر روی محیط کشت به وسیله ی چرخاندن آرام آن ها به وسیله ی دست در یک سطح افقی انجام می شود. ظروف پتری دیش بعد از گذشت یک دوره ی زمانی که ممکن است از 2تا 20 روز بسته به گونه های قارچ متفاوت است، بررسی می شود. برخی از محققان عیب این روش را این می دانند که این روش مناسب گونه هایی است اسپورد در خاک تولید می کنند و حتی تخمین بیشتری از جمعیت آنها به دست می دهد. این در حالی است که همین روش به ضرر قارچ هایی است که به شکل میسلیوم در خاک حاضر بوده و به همین دلیل به ندرت جداسازی می شوند (داوت و راکسل، 2006).

 

آماده کردن محیط کشت جداسازی

قارچ ها در یک محیط مایع خیلی خوب رشد می کنند. با وجود این اگر خواهان مطالعه ی میکروفلوقارچی هم راه با بک بیوتاپ ویژه باشیم، لازم است برای بدست آوردن پرگنه های مجزا از یک کشت جامد استفاده می کنیم. به علاوه باید مراقبت نمود تا پرگنه های قارچ، زمانی که روی مواد غذایی به سرعت در حال رشد می باشند، با همدیگر ادغام نشوند زیرا در غیر این صورت مشاهده و جداسازی آن ها غیر ممکن خواهد بود. از این رو یک محیط کشت جداسازی نباید خیلی غنی از مواد غذایی باشد. گاهی محیط کشت می تواند حاوی بازدارنده های رشد (مواد فعال سطحی) یا حتی (از نظر مواد غذایی) بسیار ضعیف باشد (آب آگار).یک محیط کشت باید حاوی یک منبع کربن، یک منبع نیتروژن و نیز نمک های مختلف معدنی باشد تا رشد قارچ را باعث شود (داوت و راکسل، 2006).

محیط های کشت پایه برای جداسازی قارچ های خاک کاملاً نامناسب می باشند زیرا که این محیط ها به باکتری ها نیز اجازه رشد می دهند در نتیجه این محیط ها باید به طوری آماده شوند که بدون جلوگیری از رشد قارچ مانع رشد باکتری ها شوند به این هدف می توان از طریق دستکاری pH محیط یا با اضافه نمودن عوامل ضد باکتری های (اسید لاکتیک) به محیط کشت دست یافت.محیط کشت برای رشد قارچ های مورد نظر باید محیط کشت انتخابی باشد.محیط کشت انتخابی محیطی است که برای جلوگیری از قارچ ها و باکتری ها و ...  عوامل مزاحم باید موادی از قبیل اسید لاکتیک و قارچ کش ها ،تریتون ، Nacl و ... دیگر مواد به آنها اضافه نمود.

 

قارچ کش ها

از عوامل انتخابی هستند که طور گسترده ای در محیط کشت جداسازی استفاده می شود قارچ کش های دارای طیف تأثیری محدود می باشند، ترکیب می شوند.قارچ کش های دارای طیف تأثیر وسیع به حذف تمام قارچ هایی کمک می نمایدن که متعلق به خانواده ها یا رده هایی هستند که از گونه مورد نظر دور
می باشند.
برای مثال برای جداسازی قارچ های اُامیست باید سمسوم کینتوزن و بنومیل که باعث حذف قارچ های با ریسه دیواردار می شود، استفاده نمود. البته متأسفانه هنوز ترکیبی که دارای طیف تأثیر وسیع علیه قارچ های زیگومیست باشد در دسترس نیست و سم هایمکسازول که بر علیه پی تیوم و آفانومایسس خیلی مؤثر است ولی روی فیتوفترا تأثیری ندارد.

 

وسایل و مواد مورد نیاز:

1-     آب مقطر استریل                           1 لیتر

2-     پودر محیط کشت PDA                 39 گرم

3-     دینرجنت                                     3-2 قطره

4-     پتردیش 6 سانتی متری جهت ریختن محیط کشت

5-     لوله آزمایش استریل جهت تهیه سوسپانسیون

6-      دستگاه اتوکلاو برای استریل کردن لوله ها و آب مقطر

7-     پیت استریل برای برداشت سوسپانسیون و انتقال به محیط کشت.

8-     اسکارپر برای جداسازی کلنی های قارچ و خالص سازی آنها.

9-     در صورتی که پودر PDA  نداشته به موادی از قبیل  سیب زمینی  دکستروز  آگار  احتیاج داشته

10- مواد  از قبیل اسید لاکتیک ، تریتون ، نمک و...

 

  خواص ظاهری قارچ برای شناسایی

باید به مشخصات ظاهری انها توجه کرد که بشرح زیر میباشد

1.       میزان رشد کلنی

2.       حالت وشکل کلنی (مسطح ، برجسته ، منظم ، نامنظم ، چین دار)

3.       منظره سطحی کلنی (شبه مخمری ، پوستی، دانه ای ، پودری ، مخمری ، پنبه ای ، کرکی ، مومی، پرزی وپشمی )

4.       رنگ کلنی (سفید ، زرد، سبز ، کرم شیری ، قرمز ، خاکستری و . . .  )

5.       وجود اگزودات در سطح کلنی

6.       رنگ پشت کلنی (بی رنگ ، زرد ، . . .  )

در آزمایش میکروسکپی نمونه ها قارچی میبایست به نکات زیر توجه کرد

  1. میسیلوم های قارچ ، وجود انشعابات ودیواره های عرضی
  2. اسپورهای جنسی و غیر جنسی
  3. ساختار های ضمیمه ای

نمونه های جمع آوری شده

  1. ریزوسفر درخت سیب
  2. آّ ب سد درودزن
  3. خاک مزرعه نزدیک سد وکه سال قبل گوجه کشت شده بود
  4. خاک برگ درخت بلوط
  5. خاک درخت انار  منطقه سیدان

روش های کشت نمونه

1.        سرس رقت  و تهبه سوسپانسیون

2.       تله با استفاده از کاغذ صافی

3.       تله با استفاده از برگ مرکبات

4.       کشت مستقیم نمونه ها

 

روش کار

محیط کشت مورد استفاده محیط کشت عصاره سیب زمینی و دکستروز و آگار (PDA) + دیترجنت + اسید لاکتیک برای ساخت محیط کشت 39 گرم از پودر محیط درون 1 لیتر آب مقطر مخلوط کرده و سپس توسط دستگاه اتوکلاو استریل نموده و سرد می کنیم و پس از سرد شدن مقدار 2 قطره دیترجنت به محلول محیط اضافه می کنیم، محلول را درون ظروف (پتری دیش) نگه داری می کنیم.در صورت نبود PDA آماده ٢٠٠ گرم  سیب زمینی ، ٢٠ گرم دکستروز و ١٨ گرم آگار در یک لیتر آب مقطر استفاده میکنیم .

برای محیط کشت اختصاصی که در ان ریزوپوس رشد نکند از مواد و درصد های زیر استفاده شد

 برای 100ml محیط کشت 2/0گرم NaCl و 300میکرو لیتر تریتون استفاده شد .

تهیه سوسپانسیون خاک

مقدار 10 گرم خاک را درون 90 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته و محلول  ساخته و سپس مقدار 10 میلی لیتر از محلول مورد نظر را درون 90 میلی لیتر آب مقطر استریل دیگر ریخته و محلول  بدست می آید و سپس مقدار 10 میلی لیتر از محلول مورد نظر را درون 90 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته و محلول  بدست می آید.

 

 

کشت دادن سوسپانسیون خاک بر روی محیط کشت

برای کشت روی محیط کشت از محلول  و  استفاده می کنیم. از هر محلول مقدار 1mlدر هر محیط کشت ریخته و به آرامی تکان می دهیم تا محلول به صورت یکنواخت روی محیط را بپوشاند. در نوبت اول نمونه های تهیه شده از خاک مزارع بخش کر را کشت دادیم، به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و       3 روز بعد بازرسی از نمونه و نتیجه به دلیل رشد بیش از اندازه  رایزوپوس قابل استفاده نبود و منجر به حذف کل نمونه ها شدو همچنین روشهای مختلف کشت آزمایش شد وهمه آلوده شدند . (، پیوست آخر).

در  کشت دوباره نمونه ها به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و )،در محیط کشت اختصاصی که ریزوپوس در ان نمی توانست رشد کند  کشت داده شد و قارچ ریزوپوس به خوبی کنترل شد حتی در محیط کشت های که خاک به صورت مستقیم کشت داده شد هم به خوبی کنترل شد .

بعد از مطالعه در مورد قارچ ریزوپوس در محیط کشت ها می بایست از سم pcnb    استفاده ولی به دلیل در دست رس نبودن سم از روش جدید استفاده شد در  این روش به 100 میلی لیتر  محیط pdf  2. گرم NaCl   و 300میکرو لیتر تریتون اضافه کردم .

تکرار کشت نمونه ها

این در صد مواد در محیط کشت به خوبی جواب داد وقارچ ریزوپوس را به خوبی کنترل کرد.  سپس کلنی قارچ را خالص سازی و کلید کردیم .

جدا سازی قارچ فیتوفترا از خاک

برگ نارنج قطعه قطعه کرده ودر مخلوطی از اب وخاک نمونه ریخته و بعد از 24 ساعت برگ ها را روی محیط اختصاصی این این گروه یعنی محیط پارپ (محیطی که قارچ های دیگر وباکتری روی ان رشد نمی کند) وبعد از رشد میسلیوم دانه شاهدانه (قارچ تحریک می کند برای تولید اسپرانزیوم) روی ان گذاشته تا ریسه اطراف دانه را پوشانده وبعد دانه را به محیط اب مقطر استریل انتقال داده تا اسپرانژیوم تشکیل واز روی ان تشخیص قارچ داده میشود .

تله کاغذ صافی

در کشت آب صد بهترین جواب استفاده از تله بود که جواب خوبی داده و زمانی کهاز سری رقت استفاده شد هیچ قارچی رشد نکرد ودر مرحله بعد از کشت مستقیم آب صد استفاده کردیم .

تله را به محیط WA انتقال چون در این محیط فقر غذایی دارد ریسه قارچ زیاد رشد نمی کند وبرای نوک ریسه کردن وخالص سازی بسیار مناسب است.

تعداد کلنی های تشکیل شده در محیط  T+N+PDF

 نمونه خاک برگ( 3- )      35عد کلنی سبز   20 عدد سبز روشن (پنسیلیوم)      15 سبز تیره (الترناریا)  

نمونه خاک برگ (4-)        5 سبز روشن (پنسیلیوم)               1 سبز تیره (الترناریا) 

 نمونه ریزوسفر سیب (3-)           2 سفید      1 شیری        1 قرمز       3 سبز     8 سبز روشن        1 زرد ()

نمونه ریزوسفر سیب (4-)       4 سفید روشن           5 شیری

نمونه آب سد (2-)        صفر                                                    

نمونه آب سد  مستقیم کشت شده     1 سبز روشن (پنسیلیوم)      2 سبز  (الترناریا)     1 قرمز (chysosporium)        3 مشکی ( آسپرژیلوس)        2 قهوه ای (آسپرژیلوس)

خاک اطراف سد مستقیم کشت شده       4 (الترناریا)           5 (آسپیرژیلوس)

تله با کاغذ صافی آب سد          1 عدد سبز  (آسپرزیلوس)          1 سبز تیره (cladosporium)

خاک برگ مستقیم کشت شده                       15 کلنی  graphium

قارچ های جداشده

 

Saprolegnia

 ازشاخه اومیست است باعث بیماری در ماهی می شود

علائم بیماری : کرک پشمی سفید یا خاکستری رنگ که شباهت زیادی به تکه های رشته ای پنبه دارد در اطراف دهان ماهی رشد می کند که این تومور های سفید بیش تر در جاهایی که قبلاً انگل رشد کرده و یا آسیب دیدگی وجود داشته ظاهر می شوند .

  

 

               

Phytophthora

 به منظور بررسی حضور گونه‌های Phytophthora در آب‌های جاری کشاورزی در طول سال‌های 1372 تا 1373 در مسیر یک صد کیلومتری رودخانه کر از تنگ بستانک تا تقاطع رودخانه سیوند مرودشت و از رودخانه سیوند از تنگ بلاغی تا تقاطع رودخانه کر در چند نقطه مشخص به صورت ماهیانه از آب نمونه برداری شد و ضمن تعیین دما و هدایت الکتریکی بلافاصله به آزمایشگاه برده شد و پس از تعیین pH و گذرانیدن از پارچه ململ همان روز برای جداسازی قارچ با استفاده از قطعات برگ لیمو شیرین و محیط نیمه انتخابی PARPH انتقال و در دمای 25 درجه سانتیگراد تا ظهور پرگنه قرار داده شد. در اطراف هر پرگنه قارچ چند دانه جوشیده شاهدانه به مدت یک شب گذاشته شد و سپس به آب مقطر برای تولید اسپورانجیوم زیر نور فلورسانت در دمای اتاق قرار داده شد. جدایه‌های فیتوفتورا پس از تشخیص جنس و خالص سازی با استفاده از خصوصیات مرفولوژیکی و نیاز دمایی طبق کلیدهای معتبر تا حد گونه مورد شناسایی قرار گرفت. غالب گونه‌ها از نوع بدون پاپیل و گرمادوست و اکثراً متعلق به P. drechsleri و P. cryptogea بودند. این دو گونه در اکثر آب‌های جاری استان شامل منطقه مرودشت، کامفیروز، سیوند، سپیدان، یاسوج و خفر نیز وجود داشت. وفور آنها در ماه‌های بهار، تابستان و اوائل پائیز حداکثر بود ولی با سرد شدن هوا کاهش یافت. در برخی موارد گونه‌های دارای پاپیل مانند P. capsici و برخی دیگر از گونه‌های ناشناخته فیتوفتورا نیز جداسازی گردید. نوسان جمعیت گونه‌های فیتوفتورا و سایر میکروفلور آب بعد از کارخانه پتروشیمی بسیار شدید بود به طوری که در برخی مواقع سال (احتمالاً به علت آلودگی زیست محیطی آب) به صفر می‌رسید. قارچ فیتوفتورا غالباً از مسیرهای خاکی و به ندرت از کانال‌های سیمانی جداسازی شد ولی از دریاچه سد درودزن جداسازی نگردیدند. بیش از 50% از جدایه‌ها روی گیاهچه‌های طالبی شهد شیراز، بیماری‌زا بودند.

  

  

 

Rhizopus

جنس رایزوپوس از راسته موکورال و در رده زیگومیست جای دارد . این قارچ گسترش جهانی داشته و گونه های مختلف آن برای انسان اهمیت زیادی دارد . مدت مدیدی است که از این قارچ در صنایع  تخمیری  استفاده می شود. از گونه‌های مختلف آن برای تولید مواد صنعتی مهمی از جمله اسید فوماریک ، الکل ، اسیدلاکتیک  و بعضی مواد دارویی استفاده می شود . بعضی گونه های آن نیز پارازیت ضعیف بوده و برروی انواع میوه جات و سایر محصولات کشاورزی ضمن حمل و نقل و انبار کردن آن ها باعث ایجاد بیماری هایی  می گردند . بعضی گونه ها نیز موجب بروز بیماری هایی در انسان می گردند که می تواند جدی و کشنده باشد . به دلیل اهمیت این قارچ در زندگی انسان شناسایی گونه های مختلف آن حائز اهمیت می باشد. برای تشخیص گونه های رایزوپوس معمولاً از صفات ظاهری و مشخصات مورفولوژیکی استفاده می شود . اما صفات مورفولوژی معرفی شده برای گونه های مختلف ، همپوشانی و شباهت های بسیاری باهم دارند و با وجودی که این اندازه گیری ها بسیار وقت گیر می باشد در نهایت از دقت بالایی نیز برخوردار نیست با توجه به اینکه اکثر گونه های رایزوپوس توانایی تولید آنزیم های پکتیناز را دارند ، در این بررسی ، علاوه بر مطالعه ویژگی های مورفولوژی برای تفکیک گونه ها ، از روش زایموگرام نیز استفاده شد . ابتدا از جدایه های به دست آمده از میزبان های مختلف ، کشت خالص تهیه شد و پس از مطالعه صفات مورفولوژیکی و تست دما ، 177 جدایه تحت جنس Rhizopus شناسایی شدند. سپس کلیه جدایه ها  مورد آزمون زایموگرام قرار گرفتند . الگوی الکتروفورزی نمونه های مختلف با یکدیگر و با نتایج مورفولوژیکی مقایسه گردید . در این 177 نمونه از لحاظ مورفولوژیکی 3 گونه و 6 واریته شناسایی شد

 

Mucor

 

·   هایفی این قارچ که از رده زایگومیست هاست پهن و فاقد دیواره عرضی است ولی گاه دیواره عرضی به صورت پراکنده و دور از هم تشکیل می شود.

·        اسپورنژیوفرهای آن کوتاه و مستقیم هستند و به سمت راس باریک می شوند.

·        کالیوملا ساختمان گنبدی شکلی که در انتهای اسپورنژیوفر قرار دارد شفاف یا تیره

·        است و بعد از پاره شدن اسپورنژیوم به خوبی مشاهده می شود.

·        اسپورنژیوم های کوچک کالیوملا نامیده می شود .

·        اسپورنژیوم ها, گرد , خاکستری تا سیاه رنگ و پر از اسپورنژیوسپور هستند .

·   اسپورنژیوسپورها بعد از پاره شدن اسپورنژیوم آزاد می گردند .گاه اسپورنژیوم پاره می شود و به صورت حلقه ای روی پایه به جا می ماند .اسپورنژیوسپورهای این قارچ گرد یا کمی کشیده هستند.

·        اسپورهای این قارچ آلرژن بوده ودر افراد مستعد ایجاد حساسیت می کند.      عامل سقط جنین در گاو ها نیز گزارش شده است

 Aspergillus

 

·        در همه گونه های آسپرژیلوس هایف های شفاف با دیواره عرضی مشاهده می شود.

·   کنیدیوفرها از یک سلول پایه به نام foot cell برروی هایفهای اصلی منشا می گیرند ودر انتها به یک ویزیکول ختم می شوند .

·        رنگ و شکل کنیدیوفرها در گونه های مختلف آسپرژیلوس متفاوت است .

·   فایلیدهای فلاسک مانند ممکن است در یک  یا دو ردیف در تمام سطح وزیکول یا در انتهای آن قرار گیرند. روی فایلیدهای , کنیدیوم های گرد به صورت زنجیرهای شعاعی مشاهده می شوند .

·   آسپرژیلوزیس یک عفونت قارچی فرصت طلب است که توسط آسپرژیلوسها ایجاد می شود . در نمونه های بالینی افراد مبتلا به این بیماری , هایفی با دیواره عرضی و انشعاباتی دو شاخه دیده می شود وواکنش بافتی التهابی چرکی حاد همراه با نکروز ایسکمیک ظاهر می گردد

 Penicillium

 

·        تمام گونه های پنی سلیوم هایفی شفاف با دیواره عرضی دارند .

·        کنیدیوفرها ساده یا منشعب هستند .

·   متیولاها به صورت انشعابات ثانویه روی کنیدیوفرها قرار دارند و فیلیدهای فاسک مانند روی آنها مشاهده می شود که منظره ای شبیه قلم موی بادبزنی ایجاد می کنند .

·        کنیدیوم ها گرد و تک سلولی به صورت زنجیره های غیر منشعب روی فایلیدها دیده می شوند .

·   یکی ار شایعترین قارچهای ساپروفیت موجود در طبیعت است که به آسانی در خاک , مواد گیاهی و موا غذایی در حال فسادرشد می کند .

·        اغلب روی مواد غذایی مانند نان , میوه ها , سبزیجات , مرکبات , ترشیجات و آبلیمو رشد می کنند .

·        برخی از گونه های آن قادر به تولید آنتی بیوتیک های ضد باکتریال و ضد قارچی هستند : مثل پنی سیلین

·        موارد بیماری ناشی از این جنس عبارتند از : عفونت ریوی ,  عفونت منتشره و

سیستمیک , اندوکاردیت, اندوفتالمیت, ازوفاژیت, عفونت مجرای ادراری , عفونت جلدی , اتومایکوزیسو کراتیت و ....

·        میسلیومهای رویشی شفاف, منشعب ودارا تیغه میانی است.

·        دستگاه زایشی شبیه برس می باشد .

·        کلنی ها رشد متوسط تا سریع دارند .

·        نمائی پودری تا مخملی و واجد شیارهای شعاعی از مرکز به محی می باشند .

·   کلنی ها معمولا به رنگ سبز و یا آبی دیده می شوند لیکن ممکن است به رنگ های سفید . زرد و قرمز مایل به ارغوانی نیز دیده شوند .

·        رنگ پشتی کلنی زرد یا طلایی است

 

   

 

Cladosporium

 

·        کلادوسپوریوم یک قارچ سیاه است که هایفی و کنیدیوفر آن به رنگ قهوا ای است .

·        دیواره ی عرضی دارند .

·        کنیدیوم های آن نیز پیگمانته و بیضوی یا استوانه ای شکل می باشد . و محل جوشگاه روی آنها دیده می شود .

·        کنیدیومها زنجیره های منشعبی را تشکیل می دهند و به آسانی از هم جدا می شوند

·        سرما دوست بوده قادرند در دمای 8 زیر صفر نیز رشد و تکثیر نمایند .

·        اغلب جزو آلوده کننده های مواد گوشتی به ویژه گوشتهای منجمد و یخ زده هستند .

·   بیماریهای گزارش شده شامل عفونت ریوی , جلدی و زیرجلدی , کراتیت و اونیکومایکوزیس می باشند .

   

 

Chrysosporium

 

·      گونه های این جنس کراتین دوست بوده , بر روی باقی مانده های مو و پرو خاک زندگی می کنند

·        8 گونه عامل بیماری در انسان گزارش شده است . اما مهم ترین گونه تروپیکوم است.

·   موارد بیماری که تا کنون گزارش شده عفونت سیستمیک ,  عفونت های سحی و جلدی و اونیکومایکوزیس می باشد.

·   رشد متوسط داشته , پودری , دانه ای , کرکی و یا پشمی بوده و به رنگ های سفید , زرد , خرمایی , صورتی و خاکستری کم رنگ دیده می شوند.

·        فاقد کونید یوفر مشخص می باشند.

·   کونید یا تک سلولی و شفاف بوده توسط زائده یا دنباله ای در قاعده به کونیدیوفر متصل می شوند . که اصطلاحا آلوریوکونیدیا می نامند.·   کونیدی کرایزوسپوریوم مشابه میکروکونیدی درماتوفیت های جنس ترایکوفایتون و میکروسپوریوم

 

Alternaria                 

کنیدیوفور های این شبه جنس تیره می باشند کهروی آن کنیدیوم های تیره  با دیواره عرضی وطولی غالبا به صورت زنجیری ساده یا منشعب روی کنیدیوفور بوجود می آیند کنیدیوم ها به شکل های گرز وارونه ، بیضوی شکل یا تخم مرغی هستند  مهمترین بیماری ایجاد شده در این شبه جنس لکه موجی میباشد.

Graphium

 

کرومیوم در این شبه جنش به رنگ تیره ودر انتهای آن توده ای از اسپور ها در یک ماده چسپنده قرار میگیرند کنیدیوفور های بی رنگ به تعداد زیاد در پایه کرومیوم قرار  می گیرند کنیدیوم ها یک سلولی وبه روش جوانه زنی تکثیر می یابند . این قارچ فرم غیر جنسی Ceratorystisulmi   عامل مرگ هلندی نارون می باشد .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نتیجه  گیری

 

    خاک های  اطراف مرودشت و بخش کر  آلوده به قارچ های  rhizopus و mocur   و دربهار سال 92 خسارت زیادی به سینی نشاه در کشت میکا نیزه  برنج  در منطقه شد  لازم است در مورد این موضوع  مطالعات بیشتری انجام شود.  

از خاک های روستای گرمه بخش کر قارچ Saprolegnia      جدا سازی که باعث بیماری  در ماهی شده  ولی این بیماری هنوزدر پرورش ماهی ها  گزارش نشده  است .

قارچ جدا شده از خاک برگ درخت بلوط  Graphium بود این قارچ فرم غیر جنسی  عامل بیماری مرگ هلندی نارون است .

  در صد مواد کنترل کننده ای که برای قارچ ریزوپوس استفاده شد باید کمتر کنیم چون تاثیر منفی روی رشد قارچ های خاکزی دارد .

                                                                     

 

 

 

 

منابع و مآخذ:

1-     داوت و راکسل، پییرو فرانسیس. (2006). ردیابی و جداسازی قارچ های خاک. ترجمه: رضا فرخی نژاد و سید علی موسوی جرف، انتشارات دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، چاپ اول.

2-     اگریوس، چرج ان. (2005). بیماری شناسی گیاهی. ترجمه: کرامت اله ایزدپناه و سید محمد اشکان، ضیاء الدین بنی هاشمی، حشمت الله رحیمیان و واهه میناسیان، انتشارات آییژ، تهران: چاپ اول.