کلینیک گیاه پزشکی کُر

مدیریت بیماری ها، آفات و علف های هرز گیاهان زراعی

کلینیک گیاه پزشکی کُر

مدیریت بیماری ها، آفات و علف های هرز گیاهان زراعی

پیام های کوتاه
آخرین نظرات

زیست شناسی مکانیزم وکاربردهای خاموشی ژن از طریق مداخله RNA

(RNA Interference )(RNAi)

۱ -  مقدمه :

خاموشی یک مکانیسم تنظیم بیان ژنها و تدبیر دفاعی سلولهای زنده بر علیه توالی های DNA پارازیت از قبیل ترانسپوزونها٬ رتروترانسپوزونها ٬ رتروپوزونها و توالی های DNA  و RNA  از ویروسها میباشد. متیلاسیون DNA و خاموشی ژن در سطح نسخه برداری (TGS) بطور عمده مسئول این است که وفور جابه جایی ها را در حد می نمیمم حفظ کند . اما خاموشی ﮊن در سطح پس از نسخه برداری (PTGS) همچنین حفاظت اضافی بر علیه ناپایداری ژنومی ایجاد شده توسط ترانسپوزون ها را فراهم می کند .

موتاسیون ها در ﮊن mut-7 در C.elegans باعث افزایش وفور جابه جایی ها شد و میزان RNAi کاهش یافت  که نشان دهنده دست داشتن RNAi در کنترل ترانسپوزون ها می باشد.اخیراً Djikeng و همکارانش  در یک فرآیند مداخله RNA یا RNAi که در Trypanosoma  brucei اتفاق می افتاد siRNA های تولید شده را کلون و تعیین توالی کردند با تعیین توالی بیش از ۱۳۰۰ قطعه شبیه siRNA آنها قطعات ۲۴ تا ۲۶ نوکلئوتیدی فراوانی را که با رتروترانسپوزون INGI که به فراوانی در همه جا هست و رتروپوزون SLACS همولوگ بودند  شناسایی کردند بنابراین آنها متقاعد شدندکه RNAi در خاموشی نسخه های رتروپوزون نقش دارد.

 خاموشی ژن به پدیده کاهش یا توقف بیان یک ژن اطلاق می شود. نقطه شروع مطالعات خاموشی ژن به کوشش هایی بر می گردد که برای افزایش بیان ژن خاص درموجودات مورد نظر انجام گرفته است.

۲ انواع خاموشی ﮊن :

خاموشی ژن را به دو دسته تقسیم می کنند:

 ۱-۲: دسته اول خاموشی ژن بر اثر هتروکروماتین شدن (Heterochromatin)DNA است این اصطلاح در مقابل کروماتین فعال (Euchromatin)که در آن  ژنها فعالانه بیان میشوند بکار میرود.در این نوع از خاموشی ساختار کروماتین از نظر شکل ظاهری تغییر کرده و متراکم میشود و گروههای آمینی پروتئین های هیستونی در محل هتروکروماتین داستیله میشوند( deacetylated histones) . این تغییرات در مجموع مانع از نسخه برداری ژن میگردد.

۲-۲ : دسته دوم خاموشی ژن مبتنی بر مشابهت در توالی میباشد.که با عنوان HDGS مطرح میشود.

) silencing    ( Homology-depended geneبسته به سطحی که در آن خاموشی رخ می دهد دو نوع از (HDGS) تشخیص داده شده است:

الف) خاموشی ژن در سطح پس از رونویسی ( PTGS)  (Post-Transcriptional gene silencing).

 ب ) خاموشی ژن در سطح رونویسی (Transcriptional gene silencing) (TGS).

 

 ۱-۲-۲- خاموشی ژن پس از نسخه برداری)  (PTGS:

خاموشی ژن پس از نسخه برداری در گیاهان با PTGS در قارچ ها با نام فرونشانی Quelling و در حیوانات به نام تزاحمRNA  یاRNAi (RNA interference) شناخته می شود . در گیاهان خاموشی در سطح پس از نسخه برداری می تواند توسط ویروس نیز القا شود که به آن خاموشی ژن القا شده توسط ویروس یاVIGS (Virus Induced gene silencing)گفته می شود. مشخصه عمومی PTGS در همه موجودات کاهشی اختصاصی در سطح mRNA ژن داخلی و ژن مشابه وارد شده می باشد. در واقع بیشتر پدیده های PTGS با استفاده از خاصیت کاهش فعالیت ژن داخلی شناسایی شده است.

۱-۱-۲-۲ : PTGS در گیاهان:

در گیاهان در اولین کوشش دانشمندان سعی کردند با بیان ژن آنزیم سنتز کننده شالکون تحت یک پروموتر قوی که آنزیمی کلیدی در تولید رنگدانه آنتوسیاتین است میزان رنگ گل های گیاه اطلسی (petunia) را افزایش دهند که گوناگونی زیادی در رنگ ها مشاهده شدو سطح بخشهای سفید رنگ در گلبرگها افزایش یافت(تصویر١) این پدیده نشان دهنده  بیان پایین و یا عدم بیان  ژن داخلی و  ترانسژن میباشد اما در هسته های جداسازی شده مشاهده شد که نسخه برداری از  ژنها به خوبی انجام میشود بنابر این خاموشی آنها باید در سطح پس از رو نویسی اتفاق افتاده باشدو اصطلاح cosuppression یا هم مهاری به معنای مهار هم زمان ترانسژن و ژن داخلی برای این پدیده بکار گرفته شد.(1990 , jorgensen).

در همان زمانها دو آزمایشگاه دیگر نیز گزارش کردند که معرفی یا وارد کردن سنس ترانسژن ها در حال نسخه برداری می توانند بیان ژنهای داخلی همولوگ را کاهش دهند . به تدریج تعداد زیادی وقایع مشابه از هم مهاری گزارش شدند . در تمام حالات هم مهاری در نتیجه تخریبRNA  های ترانسژن و اندوژن بعد از نسخه برداری هسته ای اتفاق افتاده است از آنجایی که تخریبRNA بعد از نسخه برداری در محدوده وسیعی از ترانسژن های، گیاهی باکتریایی و یا توالی های ویروسی مشاهده شد، مجدداً بعنوان خاموشی ژن در سطح بعد از نسخه برداری یا PTGS نامگذاری شد .

PTGS نه تنها می تواند با ترانسژن های سنس شروع شود بلکه با ترانسژن های آنتی سنس نیز شروع می شود و شواهد بیوشیمیایی نشان می دهد که در هر دو حالت مکانیزمهای مشابهی وجود دارد . اگر چه پدیده هم مهاری ابتدا در گیاهان مشاهده شده اما این پدیده تنها به گیاهان محدود نمی شود و در متازوآ و پستانداران نیز مشاهده می شود .

در استفاده از سنس، رشته داخل ﮊنوم قرار می گیرد و پس از نسخه برداری آنتی سنس mRNA را تولید می کند که با آن مکمل می شود اما در آنتی سنس این رشته مستقیماً با mRNA که مکمل آن است جفت می شود . به مرور زمان مشخص شد که بیان ترانسژن منجر به تشکیل RNA دو رشته ای می شود که به نوبه خود منجر به شروع PTGS می شود بعنوان مثال در حالت گیاهان اطلسی هم مهاری شده، mRNA مربوط به ژن chsA، در یک ناحیه دو رشته ای می شود زیرا نواحی وجود دارند که توانایی خود مکملی دارند و بین 3' ناحیه کد کننده و 3' ناحیه ای که ترجمه نمی شود قرار می گیرند این مسئله از طریق تشخیص های آزمایشگاهی که نشان دهنده مقاومت ناحیه دو رشته ای شده chsA به آنزیم RNase بود بدست آمد . دریک بررسی جداگانه p35s-ACC سنس ترانسژن

(ACC: 1 amino cyclopropane-1- carboxylate [Acc] oxidase) ، که یک ناحیه کوچک تکراری معکوس را در ناحیه  غیر قابل ترجمه ´5 حمل می کرد به گوجه فرنگی وارد شد تا نقشRNA دو رشته ای بعنوان یک القاء کننده PTGS بررسی شود . بازداری هم زمان ترانسژن و ژن داخلیacc با تکرار زیادی در این گیاهان اتفاق افتاد که میزان آن نسبت به گیاهانی که تنها ترانشرن سنسp35s-ACC را بدون تکرار معکوس داشتند خیلی زیاد بود. گزارشهایی از تعدادی از آزمایشگاهها در چند سال اخیر بیان کرده اند که اگر ساختمان ترانسژن طراحی شده در گیاهان ترانسژنیک منجر به جفت شدن نسخ هسته ای و ایجاد حالت دو رشته ای شود فقدان حالت پایدار در تجمع  mRNA هدف اتفاق می افتد.

در سالهای اخیر گزارش شد که بیانRNA  خود مکملSelf-cRNA مربوط به ویروسPlum pox تحت کنترل پروموتر rolc منجر به تجزیه RNA ویروسی ترانسژنیک می شود و در نتیجه مقاومت سیستمیک به ویروس بیماریزا plum pox با تکرار زیاد در گیاهان ترانسژنیک Nicotiana benthamiana  ایجاد شد .

این مدرک نشان داد که تولید RNA دو رشته ای برای آغاز PTGS در گیاهان لازم است بر این اساس گیاهانی که به مقدار زیاد ترانسژن های در حال نسخه برداری را در هر دو جهت سنس و آنتی سنس حمل می کنند اخیراً تولید شده اند که جنبه های PTGS را بصورت قوی نشان می دهند . این گیاهان ترانسژنیک می توانند ژنهای داخلی ،RNA ویروسی بیماریزا، و یا ژنهای ناخواسته خارجی را با ترادف خاص و به صورت قابل انتقال به نسل بعد خاموش کنند .

در حالت عمومی رشته های سنس و آنتی سنس در گیاهان ترانسژنیک فوق تنها توسط یک اینترون از هم جدا می شوند تا میزان تاثیر PTGS  افزایش یابد

برای مثال Arabidopsis thaliana و Lycopersicon  esculentom توسط یک ترانسژن طراحی شده ترانسفورم شدند تا بتوانند به صورت خود مکملی نسخه های iaaM و ipt را تولید کنند . iaaM و ipt ژنهای غده زایی اگروباکتریوم هستند که مسئول تشکیل گال طوقه در گیاهان آلوده می باشند . لاین های ترانسژنیک حساسیت به انتقال اگروباکتریوم را حفظ کردند اما میزان تومورزایی بصورت چشمگیری کاهش پیدا کرد که این مقاومت به گال طوقه توسط تجزیه و تخریب نسخه های mRNA از ژنهای iaaM و ipt پس از نسخه برداری ایجاد شد .

۲-۱-۲-۲: Quelling  در قارچها :

در قارچ Neurospora crassa استرینی از قارچ را که حامل نوع وحشی ژن تولید کننده رنگ نارنجی (al1+) بود جهت افزایش تولید رنگدانه نارنجی مورد مطالعه قرار دادند.به این منظور ژن al1  را تحت یک پروموتر قوی به آن منتقل کردند بر خلاف انتظار با خاموشی هر دو ژن و فنوتیپ آلبینو یا بدون رنگ مواجه شدند (Cogoni and Macino,1996).